用一張芯片把你的皮膚組織瞬間變成血管或神經細胞，這聽起來實在是太過科幻。然而印第安納大學和俄亥俄大學的研究人員不但將其成了現實，還將芯片的制作技術全部開源。也就是說如果你掌握所需的醫學知識，在五到六天之內就能按照說明書制造出一款自己中意的 VIP 組織轉換芯片！

在這篇刊登于Nature Protocols，名為 Fabrication and use of silicon hollow-needle arrays to achieve tissue nanotransfection in mouse tissue in vivo 的論文中，印第安納大學的科學家們詳細闡述了這種非侵入式且對人體無害的黑科技 。利用電穿孔技術，你可以在毫秒內將質粒 DNA 直接導入到小鼠（或自己）皮膚的特定深度，將皮膚轉染為血管或神經細胞。

nanotransfection 示意圖 | 來源：印第安納大學

作者稱，這種“組織納米轉染技術”（tissue nanotransfection, TNT）所需要的設備是可以標準化批量生產的。“組織納米轉染技術”的最大優點是不需要用病毒作為載體，從而最大限度地降低了炎癥反應和細胞死亡的風險。

發明這項技術的印第安納再生醫學和工程中心（Indiana Center For Regenerative Medicine And Engineering）主任 Chanda Sen 表示：“這篇論文將讓更多人一同參與到再生醫學中來。”

制備空心微針陣列

根據“納米轉染”說明書，改變組織功能共分為三個步驟（共 25 個具體操作環節）：制備空心微針陣列、制備 TNT 器件，以及對細胞進行轉染。首先要考慮的是使用哪種微針陣列，各種不同形態的微針總有一款適合您。對于在局部皮膚導入質粒 DNA，作者建議使用尖端扁平的微針（見圖 1A）。對于深層組織的導入，作者建議使用尖端鋒利的微針以促進組織穿透( 見圖 1B 或 1C)。

各種微針 | 來源：論文

選好款式以后我們就要進行手工制作了。

首先需要在雙面拋光的 4 英寸硅（Si100）晶片上覆蓋一層光刻膠，然后使用博世（Bosch）工藝對晶片進行深反應離子刻蝕（DRIE）。根據轉染需要可以制備三種不同的硅空心微針，包括頂端扁平的一型（圖 1E，Type I），頂端突出的二型（Type II）或帶有偏心孔的三型（Type III）（圖 1F，g)。后兩種尖端鋒利的微針陣列更有助于穿透到組織當中。如果將針頭的納米通道直徑縮小，那么針頭輸出生物分子的速度也將相應增加；但是相應來說，這也可能限制通過針頭的分子總量。在納米通道直徑過小（<5 μm）的微針中通常可以觀察到分子堵塞現象。這個問題可以通過優化孔徑和使用偏心孔結構（Type III）來解決。通過使用等離子體增強化學氣相沉積（PECVD）形成氧化物涂層，可以將納米通道直徑調整到目標值。此外，研究人員在在每個硅芯片上都連接了一個 Transwell，作為質粒 DNA 的儲存庫。 論文強調，要想做出高質量的微針陣列，必須特別注意兩個方面。第一個是在翻轉芯片以制造微針的納米通道時需要精確對準（步驟 1A（Xix）），第二個是在制作的過程中要溫柔，以避免針孔中出現堵塞的現象（步驟 1A（xxii，xxvii 和 xxiv））。

TNT 器件的制備

在芯片制作好之后，需要將其和電穿孔設備進行整合以實現質粒 DNA 的導入。首先 TNT 芯片上安裝有一個儲液器，用來儲存有質粒 DNA 的溶液。為了實現納米電穿孔，還需要一種精確控制的電脈沖發生器。研究人員用 PDMS 和固化劑混合，形成可嵌入芯片的 PDMS 薄膜。之后，芯片的正面、底面和 PDMS 膜的底面都用等粒子清洗機處理過，然后輕輕地壓在一起，在各層之間形成完整的粘合。PDMS 膜的厚度應調整為 2-4 毫米。 論文表示，大于 4 毫米的 PDMS 膜不夠靈活，不足以在芯片之間提供完全的防泄漏連接，而且還可能在連接過程中損壞芯片。而小于 2 毫米的 PDMS 膜又太柔軟，因此在芯片和薄膜之間會產生褶皺和氣隙。

小鼠實驗 | 來源：論文

使用 TNT 器件進行體內轉染

當利用電穿孔技術將 DNA 導入到體內時，所施加的電壓決定了 DNA 分子上的遷移力有多大，從而決定了在恒定脈沖下導入的距離有多遠。同時，電壓還決定了電穿孔過程中細胞膜上的孔密度和平均孔徑。中等電壓（100-150 V/mm）可以平衡導入距離和孔隙參數。過高的電壓會破壞細胞和組織結構。在實驗中，研究人員使用了 8 到 12 周大的雄性小鼠。不過這并不代表活體小鼠實驗局限于任何性別或年齡，任何小鼠都可以參與 。 為了便于 TNT 芯片能接觸到皮膚更深層的細胞組織，實驗中的小鼠都被脫毛。之后電脈沖通過裝有質粒溶液的儲液器和微針達到皮膚。該電脈沖為方波，參數可調。以 200 V 電壓開始，穿孔脈沖電壓可以不斷增加以促進細胞膜孔隙的形成，之后再以 200 V 的驅動脈沖將質粒導入組織。較高的電壓（>250 V）會增加驅動力，并在細胞膜上產生更大的孔隙，這有助于質粒的傳遞。但如果電壓太大的話就會對細胞產生毒性。 作者表示，這款帶有硅空心微針陣列的 TNT 芯片的最終目標是對組織進行重新編程。在這款芯片的幫助下，實驗小鼠避免了后肢的組織壞死，甚至移植到大腦的神經細胞還改善了中風小鼠的神經功能。目前，科學家們還沒有在人類身上進行大規模的臨床試驗。但在制備納米芯片的方法開源以后，想必會引來大批生物駭客的興趣。

屆時又會有怎樣神奇的發現，我們拭目以待。

參考文獻：https://www.nature.com/articles/s41596-021-00631-0

本文來自微信公眾號 “學術頭條”（ID：SciTouTiao），作者：學術頭條，36氪經授權發布。